O ṣeun fun lilo si Nature.com.Ẹya ẹrọ aṣawakiri ti o nlo ni atilẹyin CSS lopin.Fun iriri ti o dara julọ, a ṣeduro pe ki o lo ẹrọ aṣawakiri imudojuiwọn kan (tabi mu Ipo Ibamu ṣiṣẹ ni Internet Explorer).Lakoko, lati rii daju pe atilẹyin tẹsiwaju, a yoo ṣe aaye naa laisi awọn aza ati JavaScript.
Awọn olutọpa Jiini fun itọju ti cystic fibrosis ẹdọforo gbọdọ wa ni ìfọkànsí si awọn ọna atẹgun conductive, niwọn igba ti gbigbe ẹdọfóró agbeegbe ko ni ipa itọju ailera.Iṣiṣẹ ti transduction gbogun ti ni ibatan taara si akoko ibugbe ti awọn ti ngbe.Bibẹẹkọ, awọn fifa ifijiṣẹ bii awọn ti ngbe jiini ntan kaakiri sinu alveoli lakoko ifasimu, ati awọn patikulu iwosan ti eyikeyi apẹrẹ ti yọkuro ni iyara nipasẹ gbigbe mucociliary.Gbigbe akoko ibugbe ti awọn gbigbe jiini ni apa atẹgun jẹ pataki ṣugbọn o ṣoro lati ṣaṣeyọri.Awọn patikulu oofa ti ngbe-conjugated ti o le ṣe itọsọna si dada ti atẹgun atẹgun le ṣe ilọsiwaju idojukọ agbegbe.Nitori awọn iṣoro pẹlu aworan in vivo, ihuwasi ti iru awọn patikulu oofa kekere lori oju ọna atẹgun ni iwaju aaye oofa ti a lo ko loye.Ero ti iwadii yii ni lati lo aworan synchrotron lati wo inu vivo iṣipopada lẹsẹsẹ ti awọn patikulu oofa ninu ọra ti awọn eku anesthetized lati le ṣe iwadi awọn agbara ati awọn ilana ihuwasi ti ẹyọkan ati awọn patikulu olopobobo ni vivo.Lẹhinna a tun ṣe ayẹwo boya ifijiṣẹ awọn patikulu oofa lentiviral ni iwaju aaye oofa kan yoo mu iṣẹ ṣiṣe ti gbigbe sinu trachea eku pọ si.Aworan X-ray Synchrotron fihan ihuwasi ti awọn patikulu oofa ni iduro ati gbigbe awọn aaye oofa ni fitiro ati ni vivo.Awọn patikulu ko le ni irọrun fa lori oju ti awọn ọna atẹgun gbigbe ni lilo awọn oofa, ṣugbọn lakoko gbigbe, awọn ohun idogo ti wa ni idojukọ ni aaye wiwo, nibiti aaye oofa ti lagbara julọ.Imudara gbigbe tun pọ si ilọpo mẹfa nigbati a ti jiṣẹ awọn patikulu oofa lentiviral ni iwaju aaye oofa kan.Papọ, awọn abajade wọnyi daba pe awọn patikulu oofa lentiviral ati awọn aaye oofa le jẹ awọn isunmọ ti o niyelori lati mu ilọsiwaju ibi-afẹde pupọ ati awọn ipele gbigbe ni awọn ọna atẹgun conductive ni vivo.
Cystic fibrosis (CF) jẹ idi nipasẹ awọn iyatọ ninu jiini kan ti a npe ni CF transmembrane conductance regulator (CFTR).Awọn amuaradagba CFTR jẹ ikanni ion ti o wa ninu ọpọlọpọ awọn sẹẹli epithelial jakejado ara, pẹlu awọn ọna atẹgun, aaye pataki kan ninu pathogenesis ti cystic fibrosis.Awọn abawọn ti o wa ninu CFTR yorisi gbigbe omi ajeji, gbigbẹ oju-ọna oju-ofurufu, ati idinku ipele omi oju-ofurufu (ASL).O tun ṣe ailagbara ti eto gbigbe mucociliary (MCT) lati ko awọn ọna atẹgun kuro ti awọn patikulu ifasimu ati awọn pathogens.Ibi-afẹde wa ni lati dagbasoke itọju jiini lentiviral (LV) lati fi ẹda ti o pe ti jiini CFTR dara ati ilọsiwaju ASL, MCT, ati ilera ẹdọfóró, ati lati tẹsiwaju idagbasoke awọn imọ-ẹrọ tuntun ti o le wiwọn awọn aye wọnyi ni vivo1.
Awọn olutọpa LV jẹ ọkan ninu awọn oludije aṣaaju fun itọju ailera apilẹṣẹ cystic fibrosis, ni pataki nitori wọn le ṣepọ patapata jiini oogun sinu awọn sẹẹli basal ọna atẹgun (awọn sẹẹli atẹgun atẹgun).Eyi ṣe pataki nitori pe wọn le ṣe atunṣe hydration deede ati imukuro mucus nipasẹ iyatọ si awọn sẹẹli oju-ọna atẹgun ti a ṣe atunṣe ti iṣẹ-ṣiṣe ti o niiṣe pẹlu cystic fibrosis, ti o mu ki awọn anfani igbesi aye.Awọn olutọpa LV gbọdọ wa ni itọsọna lodi si awọn ọna atẹgun conductive, nitori eyi ni ibi ti ilowosi ẹdọfóró ni CF bẹrẹ.Ifijiṣẹ fekito jinle si ẹdọfóró le ja si iyipada alveolar, ṣugbọn eyi ko ni ipa itọju ailera ni cystic fibrosis.Bibẹẹkọ, awọn omi-omi bii awọn ti ngbe jiini lọ nipa ti ara sinu alveoli nigba ti a fa simu lẹhin ibimọ3,4 ati awọn patikulu iwosan ni iyara titu sinu iho ẹnu nipasẹ awọn MCTs.Imudara ti gbigbe LV jẹ taara ni ibatan si ipari akoko ti fekito naa wa nitosi awọn sẹẹli afojusun lati gba gbigba cellular - “akoko ibugbe” 5 eyiti o ni irọrun kuru nipasẹ iṣan-afẹfẹ agbegbe aṣoju bi daradara bi iṣakojọpọ ti mucus ati awọn patikulu MCT.Fun cystic fibrosis, agbara lati pẹ akoko ibugbe LV ni awọn ọna atẹgun jẹ pataki lati ṣe aṣeyọri awọn ipele giga ti gbigbe ni agbegbe yii, ṣugbọn o ti jẹ nija.
Lati bori idiwo yii, a daba pe awọn patikulu oofa LV (MPs) le ṣe iranlọwọ ni awọn ọna ibaramu meji.Ni akọkọ, wọn le ṣe itọsọna nipasẹ oofa si oju-ọna oju-ofurufu lati mu ilọsiwaju idojukọ ati iranlọwọ awọn patikulu ti ngbe jiini lati wa ni agbegbe ọtun ti ọna atẹgun;ati ASL) gbe sinu cell Layer 6. MPs ti wa ni o gbajumo ni lilo bi ìfọkànsí oògùn ifijiṣẹ awọn ọkọ ti nigba ti won dè si aporo, kimoterapi oloro, tabi awọn miiran kekere moleku ti o so si cell tanna tabi dipọ si awọn oniwun wọn cell dada awọn iṣan ti o si kó ni tumo ojula ni. niwaju ina aimi.Awọn aaye oofa fun itọju ailera akàn 7. Awọn ọna “hyperthermic” miiran jẹ ifọkansi lati pa awọn sẹẹli tumo nipasẹ alapapo MPS nigbati o farahan si awọn aaye oofa oscillating.Ilana ti gbigbe oofa, ninu eyiti aaye oofa kan ti lo bi oluranlowo gbigbe lati jẹki gbigbe DNA sinu awọn sẹẹli, ni a lo ni vitro ni lilo pupọ ti kii ṣe gbogun ti ati gbogun ti awọn fakito jiini fun awọn laini sẹẹli ti o nira lati yipada ..Iṣiṣẹ ti LV magnetotransfection pẹlu ifijiṣẹ LV MP in vitro sinu laini sẹẹli ti epithelium bronchi ti eniyan ni iwaju aaye oofa ti a ti fi idi mulẹ, jijẹ ṣiṣe ti gbigbe nipasẹ awọn akoko 186 ni akawe pẹlu vector LV nikan.LV MT tun ti lo si awoṣe in vitro ti cystic fibrosis, nibiti gbigbe oofa ti pọ si gbigbe LV ni awọn aṣa wiwo omi afẹfẹ nipasẹ ipin 20 ni iwaju cystic fibrosis sputum10.Bibẹẹkọ, ni vivo ohun ara magnetotransfection ti gba akiyesi diẹ diẹ ati pe a ti ṣe ayẹwo nikan ni awọn iwadii ẹranko diẹ11,12,13,14,15, ni pataki ninu ẹdọforo16,17.Sibẹsibẹ, awọn iṣeeṣe ti gbigbe oofa ni itọju ẹdọfóró ni cystic fibrosis jẹ kedere.Tan et al.(2020) ṣalaye pe “iwadi afọwọsi lori ifijiṣẹ ẹdọforo ti o munadoko ti awọn ẹwẹ titobi oofa yoo ṣe ọna fun awọn ọgbọn ifasimu CFTR iwaju lati mu awọn abajade ile-iwosan dara si ni awọn alaisan ti o ni cystic fibrosis”6.
Ihuwasi ti awọn patikulu oofa kekere lori dada ti atẹgun atẹgun ni iwaju aaye oofa ti a lo soro lati foju inu ati iwadi, ati nitorinaa wọn ko loye.Ninu awọn ẹkọ miiran, a ti ṣe agbekalẹ Synchrotron Isọdọtun ti o da lori Itọkasi Iyatọ X-Ray Imaging (PB-PCXI) ọna fun aworan ti kii ṣe invasive ati iwọn ti iṣẹju ni vivo awọn ayipada ninu ASL18 ijinle ati ihuwasi MCT19,20 lati wiwọn hydration dada ikanni gaasi taara. ati pe a lo bi imunadoko itọju itọka kutukutu.Ni afikun, ọna igbelewọn MCT wa nlo awọn patikulu iwọn ila opin 10-35 µm ti o jẹ ti alumina tabi gilasi itọka itọka giga bi awọn asami MCT ti o han pẹlu PB-PCXI21.Mejeeji ọna ni o dara fun aworan kan ibiti o ti patiku orisi, pẹlu MPS.
Nitori aaye giga ati ipinnu akoko, PB-PCXI-orisun ASL ati awọn igbelewọn MCT ti baamu daradara lati ṣe iwadi awọn agbara ati awọn ilana ihuwasi ti ẹyọkan ati awọn patikulu olopobobo ni vivo lati ṣe iranlọwọ fun wa ni oye ati mu awọn ọna ifijiṣẹ jiini MP pọ si.Ọna ti a lo nibi da lori awọn ẹkọ wa nipa lilo SPring-8 BL20B2 beamline, ninu eyiti a ṣe akiyesi iṣipopada omi lẹhin ifijiṣẹ ti iwọn lilo ti apanirun kan sinu imu ati awọn ọna atẹgun ẹdọforo ti awọn eku lati ṣe iranlọwọ lati ṣalaye awọn ilana ikosile pupọ wa ti a ṣe akiyesi. ninu apilẹṣẹ wa.awọn ẹkọ ẹranko pẹlu iwọn gbigbe ti 3.4.
Ero ti iwadi yii ni lati lo PB-PCXI synchrotron lati wo inu awọn iṣipopada vivo ti onka awọn ọmọ ile-igbimọ ni ọna atẹgun ti awọn eku laaye.Awọn ijinlẹ aworan PB-PCXI wọnyi jẹ apẹrẹ lati ṣe idanwo jara MP, agbara aaye oofa, ati ipo lati pinnu ipa wọn lori gbigbe MP.A ro pe aaye oofa ita gbangba yoo ṣe iranlọwọ fun iduro MF ti a firanṣẹ tabi gbe si agbegbe ibi-afẹde.Awọn ijinlẹ wọnyi tun gba wa laaye lati pinnu awọn atunto oofa ti o pọ si iye awọn patikulu ti o ku ninu trachea lẹhin fifisilẹ.Ninu jara keji ti awọn ẹkọ, a ni ifọkansi lati lo iṣeto ti o dara julọ lati ṣe afihan ilana gbigbe ti o waye lati inu vivo ifijiṣẹ ti LV-MPs si awọn ọna atẹgun eku, lori ero pe ifijiṣẹ ti LV-MPs ni ipo ti ifọkansi oju-ofurufu yoo ja si. ni pọ LV transduction ṣiṣe..
Gbogbo awọn ijinlẹ ẹranko ni a ṣe ni ibamu pẹlu awọn ilana ti a fọwọsi nipasẹ Ile-ẹkọ giga ti Adelaide (M-2019-060 ati M-2020-022) ati Igbimọ Ẹkọ Eranko ti SPring-8 Synchrotron.Awọn idanwo naa ni a ṣe ni ibamu pẹlu awọn iṣeduro ti ARRIVE.
Gbogbo awọn aworan x-ray ni a mu ni BL20XU beamline ni SPring-8 synchrotron ni Japan ni lilo iṣeto ti o jọra si eyiti a ṣalaye tẹlẹ21,22.Ni ṣoki, apoti idanwo naa wa ni 245 m lati oruka ipamọ synchrotron.Ayẹwo-si-oluwadi ijinna ti 0.6 m ni a lo fun awọn ijinlẹ aworan patiku ati 0.3 m fun awọn ijinlẹ aworan vivo lati ṣẹda awọn ipa itansan alakoso.Tan ina monochromatic kan pẹlu agbara ti 25 keV ni a lo.Awọn aworan ni a gba ni lilo transducer X-ray ti o ga giga (SPring-8 BM3) papọ pẹlu aṣawari sCMOS kan.Olutumọ ṣe iyipada awọn egungun X si ina ti o han nipa lilo scintillator ti o nipọn 10 µm (Gd3Al2Ga3O12), eyiti o jẹ itọsọna si sensọ sCMOS nipa lilo ibi-afẹde maikirosikopu ×10 (NA 0.3).Oluṣawari sCMOS jẹ Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japan) pẹlu titobi titobi 2048 × 2048 awọn piksẹli ati iwọn piksẹli aise ti 6.5 × 6.5 µm.Eto yii funni ni iwọn piksẹli isotropic ti o munadoko ti 0.51 µm ati aaye wiwo ti isunmọ 1.1 mm × 1.1 mm.Iye akoko ifihan ti 100 ms ni a yan lati mu iwọn ifihan-si-ariwo pọ si ti awọn patikulu oofa inu ati ita awọn ọna atẹgun lakoko ti o dinku awọn ohun-ini išipopada ti o ṣẹlẹ nipasẹ mimi.Fun awọn iwadii vivo, titu X-ray ti o yara ni a gbe si ọna X-ray lati fi opin si iwọn itọsi nipa didi ina X-ray laarin awọn ifihan.
A ko lo LV media ni eyikeyi awọn ikẹkọ aworan SPring-8 PB-PCXI nitori iyẹwu aworan BL20XU kii ṣe ifọwọsi Ipele Biosafety 2.Dipo, a yan ọpọlọpọ awọn ọmọ ile-igbimọ ti o dara julọ lati ọdọ awọn olutaja iṣowo meji ti o bo awọn iwọn titobi, awọn ohun elo, awọn ifọkansi irin, ati awọn ohun elo, - akọkọ lati le ni oye bi awọn aaye oofa ṣe ni ipa lori iṣipopada ti MPs ni awọn capillaries gilasi, ati lẹhinna ninu awọn ọna atẹgun ti ngbe.dada.Iwọn MP yatọ lati 0.25 si 18 µm ati pe a ṣe lati oriṣiriṣi awọn ohun elo (wo Tabili 1), ṣugbọn akopọ ti apẹẹrẹ kọọkan, pẹlu iwọn awọn patikulu oofa ninu MP, jẹ aimọ.Da lori awọn ẹkọ MCT nla wa 19, 20, 21, 23, 24, a nireti pe awọn ọmọ ile-igbimọ ti o wa ni isalẹ si 5 µm ni a le rii lori oju ọna atẹgun tracheal, fun apẹẹrẹ, nipa iyokuro awọn fireemu itẹlera lati rii ilọsiwaju hihan ti gbigbe MP.MP kan ti 0.25 µm kere ju ipinnu ti ẹrọ aworan, ṣugbọn PB-PCXI ni a nireti lati ṣe awari iyatọ iwọn didun wọn ati gbigbe ti omi dada lori eyiti wọn fi silẹ lẹhin ti o ti gbe wọn silẹ.
Awọn ayẹwo fun MP kọọkan ninu tabili.1 ti pese sile ni awọn capillaries gilasi 20 μl (Drummond Microcaps, PA, USA) pẹlu iwọn ila opin inu ti 0.63 mm.Awọn patikulu corpuscular wa ninu omi, lakoko ti awọn patikulu CombiMag wa ninu omi ohun-ini ti olupese.tube kọọkan jẹ idaji ti o kun fun omi (isunmọ 11 µl) ati gbe sori ohun dimu ayẹwo (wo Nọmba 1).Awọn capillaries gilasi ni a gbe ni ita lori ipele ni iyẹwu aworan, lẹsẹsẹ, ati ipo ni awọn egbegbe ti omi.A 19 mm opin (28 mm gun) nickel-ikarahun oofa ṣe ti toje aiye, neodymium, irin ati boron (NdFeB) (N35, ologbo no. LM1652, Jaycar Electronics, Australia) pẹlu kan remanence ti 1.17 T ti a so si kan. tabili gbigbe lọtọ lati ṣaṣeyọri Latọna jijin yi ipo rẹ pada lakoko ṣiṣe.Aworan X-ray bẹrẹ nigbati oofa wa ni ipo to 30 mm loke apẹẹrẹ ati awọn aworan ti wa ni ipasẹ ni awọn fireemu 4 fun iṣẹju kan.Lakoko aworan, a mu oofa naa sunmọ tube capillary gilasi (ni ijinna ti o to 1 mm) ati lẹhinna gbe pẹlu tube lati ṣe ayẹwo ipa ti agbara aaye ati ipo.
Eto aworan in vitro ti o ni awọn ayẹwo MP ninu awọn capillaries gilasi ni ipele ti itumọ ti ayẹwo xy.Ona ti X-ray tan ina ti wa ni samisi pẹlu kan pupa aami ila.
Ni kete ti a ti fi idi hihan in vitro ti awọn ọmọ ile-igbimọ duro, ipin kan ninu wọn ni idanwo ni vivo lori awọn eku obinrin Wistar albino iru-igi (~ ọsẹ 12, ~ 200 g).Medetomidine 0.24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Japan), midazolam 3.2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Japan) ati butorphanol 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).Awọn eku jẹ anesthetized pẹlu idapọ Pharma (Japan) nipasẹ abẹrẹ intraperitoneal.Lẹhin akuniloorun, wọn ti pese sile fun aworan nipa yiyọ irun ti o wa ni ayika trachea, fifi sii tube endotracheal (ET; 16 Ga intravenous cannula, Terumo BCT), ati mimu wọn kuro ni ipo ti o ga julọ lori awo aworan ti aṣa ti aṣa ti o ni apo igbona kan. lati ṣetọju iwọn otutu ara.22. Awo awo aworan lẹhinna so si ipele ipele ti o wa ninu apoti aworan ni igun diẹ lati ṣe deede trachea ni petele lori aworan x-ray bi o ṣe han ni Figure 2a.
(a) Ninu iṣeto aworan vivo ni ẹyọ aworan SPring-8, ọna ina X-ray ti samisi pẹlu laini aami pupa.(b,c) Isọdi oofa tracheal ni a ṣe latọna jijin nipa lilo awọn kamẹra IP meji ti a gbe sori orthogonally.Ni apa osi ti aworan loju iboju, o le rii lupu waya ti o mu ori ati cannula ifijiṣẹ ti a fi sori ẹrọ inu tube ET.
Eto fifa syringe isakoṣo latọna jijin (UMP2, Awọn ohun elo Precision World, Sarasota, FL) ni lilo syringe gilasi 100 µl kan ti sopọ si ọpọn PE10 kan (0.61 mm OD, ID 0.28 mm) ni lilo abẹrẹ 30 Ga.Samisi tube lati rii daju wipe awọn sample wa ni awọn ti o tọ si ipo ninu awọn trachea nigbati o ba nfi tube endotracheal sii.Lilo micropump, syringe plunger ti yọ kuro ati ipari ti tube ti wa ni immersed ninu ayẹwo MP lati wa ni jiṣẹ.tube ifijiṣẹ ti kojọpọ lẹhinna ti fi sii sinu tube endotracheal, gbigbe sample si apakan ti o lagbara julọ ti aaye oofa ti a ti ṣe yẹ wa.Gbigba aworan ni a ṣakoso ni lilo aṣawari ẹmi ti o sopọ si apoti akoko ti o da lori Arduino, ati gbogbo awọn ifihan agbara (fun apẹẹrẹ, iwọn otutu, isunmi, ṣiṣi silẹ / sunmọ, ati gbigba aworan) ni a gbasilẹ ni lilo Powerlab ati LabChart (AD Instruments, Sydney, Australia) 22 Nigbati Aworan Nigbati ile ko ba si, awọn kamẹra IP meji (Panasonic BB-SC382) wa ni ipo ni isunmọ 90 ° si ara wọn ati lo lati ṣakoso ipo oofa ti o ni ibatan si trachea lakoko aworan (Figure 2b, c).Lati dinku awọn ohun-ọṣọ išipopada, aworan kan fun ẹmi ni a gba lakoko pẹtẹlẹ ṣiṣan atẹgun ebute.
Oofa naa ti so mọ ipele keji, eyiti o le wa ni isakoṣo latọna jijin ni ita ti ara aworan.Awọn ipo oriṣiriṣi ati awọn atunto oofa ni idanwo, pẹlu: ti a gbe si igun kan ti o to 30 ° loke atẹgun (awọn atunto ti han ni Awọn nọmba 2a ati 3a);oofa kan loke ẹranko ati ekeji ni isalẹ, pẹlu awọn ọpa ti a ṣeto fun ifamọra (Aworan 3b)., oofa kan loke ẹranko ati ọkan ni isalẹ, pẹlu awọn ọpa ti a ṣeto fun ikọsilẹ (Figure 3c), ati oofa kan loke ati papẹndikula si ọna atẹgun (Figure 3d).Lẹhin ti ṣeto ẹranko ati oofa ati ikojọpọ MP labẹ idanwo sinu fifa syringe, fi iwọn lilo 50 µl ranṣẹ ni iwọn 4 µl / iṣẹju-aaya lori gbigba awọn aworan.Oofa naa yoo gbe sẹhin ati siwaju pẹlu tabi kọja ọna atẹgun lakoko ti o tẹsiwaju lati gba awọn aworan.
Iṣeto oofa fun aworan in vivo (a) oofa kan loke atẹgun ni igun kan ti o to 30°, (b) awọn oofa meji ti a tunto fun ifamọra, (c) awọn oofa meji ti a tunto fun ikọsilẹ, (d) oofa kan loke ati papẹndikula si atẹgun.Oluwoye naa wo isalẹ lati ẹnu si ẹdọforo nipasẹ ọna atẹgun ati itanna X-ray ti o kọja ni apa osi ti eku ti o si jade ni apa ọtun.Oofa naa jẹ gbigbe ni gigun ti ọna atẹgun tabi osi ati sọtun loke atẹgun si ọna ti ina X-ray.
A tun wa lati pinnu hihan ati ihuwasi ti awọn patikulu ninu awọn ọna atẹgun ni isansa ti dapọ mimi ati oṣuwọn ọkan.Nitoribẹẹ, ni opin akoko aworan, awọn ẹranko ti ni itara eniyan nitori iwọn apọju pentobarbital (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~ 65 mg/kg ip).Diẹ ninu awọn ẹranko ni a fi silẹ lori pẹpẹ aworan, ati lẹhin idinku ti mimi ati lilu ọkan, ilana aworan ti tun ṣe, fifi afikun iwọn lilo MP sii ti ko ba si MP ti o han lori oju ọna atẹgun.
Awọn aworan ti o yọrisi ni atunṣe fun alapin ati aaye dudu ati lẹhinna pejọ sinu fiimu kan (awọn fireemu 20 fun iṣẹju keji; 15–25 × iyara deede ti o da lori iwọn isunmi) ni lilo iwe afọwọkọ aṣa ti a kọ sinu MATLAB (R2020a, Awọn Mathworks).
Gbogbo awọn ijinlẹ lori ifijiṣẹ vector gene LV ni a ṣe ni Ile-ẹkọ giga ti Ile-ẹkọ Iwadi Ẹran ti Ile-ẹkọ giga ti Adelaide ati ifọkansi lati lo awọn abajade ti idanwo SPring-8 lati ṣe ayẹwo boya ifijiṣẹ LV-MP ni iwaju aaye oofa kan le mu gbigbe jiini pọ si ni vivo .Lati ṣe iṣiro awọn ipa ti MF ati aaye oofa, awọn ẹgbẹ meji ti awọn ẹranko ni a ṣe itọju: ẹgbẹ kan ni itasi pẹlu LV MF pẹlu gbigbe oofa, ati pe ẹgbẹ miiran ni itasi pẹlu ẹgbẹ iṣakoso pẹlu LV MF laisi oofa.
Awọn olutọpa jiini LV ti jẹ ipilẹṣẹ nipa lilo awọn ọna ti a ṣalaye tẹlẹ 25, 26.Fekito LacZ n ṣalaye jiini beta-galactosidase agbegbe ti iparun ti o wa nipasẹ olupolowo idawọle MPSV (LV-LacZ), eyiti o ṣe agbejade ọja ifa buluu kan ninu awọn sẹẹli ti o yipada, ti o han ni iwaju ati awọn apakan ti àsopọ ẹdọfóró.Titration ni a ṣe ni awọn aṣa sẹẹli nipasẹ kika pẹlu ọwọ nọmba awọn sẹẹli rere LacZ nipa lilo hemocytometer kan lati ṣe iṣiro titer ni TU/ml.Awọn ọkọ ayọkẹlẹ ti wa ni ipamọ ni -80 ° C, thawed ṣaaju lilo, ati dè CombiMag nipa dapọ 1: 1 ati incubating lori yinyin fun o kere ju iṣẹju 30 ṣaaju ifijiṣẹ.
Awọn eku Sprague Dawley deede (n = 3/ẹgbẹ, ~ 2-3 ip anesthetized pẹlu adalu 0.4mg/kg medetomidine (Domitor, Ilium, Australia) ati 60mg/kg ketamine (Ilium, Australia) ni oṣu kan ti ọjọ ori) ip ) abẹrẹ ati ti kii-abẹ-abẹ ẹnu cannulation pẹlu kan 16 Ga iṣan cannula.Lati rii daju pe iṣan atẹgun atẹgun ngba LV transduction, o ti wa ni ilodi si lilo ilana perturbation ẹrọ wa ti a ti sọ tẹlẹ ninu eyiti a ti fi oju-ọna atẹgun atẹgun ti axially pẹlu agbọn waya (N-Circle, nitinol stone extractor without sample NTSE-022115 ) -UDH , Cook Medical, USA) 30 p28.Lẹhinna, bii iṣẹju mẹwa 10 lẹhin ibajẹ ninu minisita biosafety, iṣakoso tracheal ti LV-MP ti ṣe.
Aaye oofa ti a lo ninu idanwo yii ni a tunto bakanna si iwadii x-ray in vivo, pẹlu awọn oofa kanna ti o waye lori atẹgun atẹgun pẹlu awọn distillation stent clamps (Aworan 4).Iwọn didun 50 µl (2 x 25 µl aliquots) ti LV-MP ni a fi jiṣẹ si ọna atẹgun (n = 3 eranko) ni lilo pipette ti o ni geli gẹgẹbi a ti ṣalaye tẹlẹ.Ẹgbẹ iṣakoso (n = 3 eranko) gba LV-MP kanna laisi lilo oofa.Lẹhin ipari ti idapo, a ti yọ cannula kuro ninu tube endotracheal ati pe a ti yọ ẹranko naa kuro.Oofa naa wa ni aaye fun iṣẹju mẹwa 10 ṣaaju ki o to yọ kuro.Awọn eku ti wa ni abẹ abẹ pẹlu meloxicam (1 milimita/kg) (Ilium, Australia) ti o tẹle pẹlu yiyọkuro akuniloorun nipasẹ abẹrẹ intraperitoneal ti 1 mg/kg atipamazole hydrochloride (Antisedan, Zoetis, Australia).Awọn eku wa ni igbona ati akiyesi titi ti imularada pipe lati akuniloorun.
Ẹrọ ifijiṣẹ LV-MP ni minisita aabo ti ibi.O le rii pe ina grẹy Luer-lock sleeve ti tube ET yọ jade lati ẹnu, ati gelu pipette sample ti o han ninu nọmba naa ti fi sii nipasẹ tube ET si ijinle ti o fẹ sinu trachea.
Ni ọsẹ kan lẹhin ilana iṣakoso LV-MP, awọn ẹranko ti rubọ pẹlu itara eniyan nipasẹ ifasimu ti 100% CO2 ati ikosile LacZ ni a ṣe ayẹwo ni lilo itọju boṣewa X-gal wa.Awọn oruka kerekere mẹta ti o pọ julọ ni a yọ kuro lati rii daju pe eyikeyi ibajẹ ẹrọ tabi idaduro omi nitori gbigbe tube endotracheal kii yoo wa ninu itupalẹ.A ge trachea kọọkan ni gigun lati gba idaji meji fun itupalẹ ati gbe sinu ago kan ti o ni rọba silikoni (Sylgard, Dow Inc) ni lilo abẹrẹ Minutien kan (Awọn irinṣẹ Imọ-jinlẹ Fine) lati wo oju oju itanna.Pipin ati ihuwasi ti awọn sẹẹli ti o yipada ni a timo nipasẹ fọtoyiya iwaju nipa lilo microscope Nikon (SMZ1500) pẹlu kamẹra DigiLite ati sọfitiwia TCapture (Tucsen Photonics, China).Awọn aworan ti a gba ni 20x magnification (pẹlu eto ti o pọju fun iwọn kikun ti trachea), pẹlu gbogbo ipari ti trachea ti o han ni ipele nipasẹ igbese, ti o pese to ni lqkan laarin aworan kọọkan lati gba awọn aworan laaye lati wa ni "aran".Awọn aworan lati inu ọra ọkọọkan lẹhinna ni idapo sinu aworan akojọpọ kan ṣoṣo nipa lilo Apejọ Aworan Aworan ti ikede 2.0.3 (Iwadi Microsoft) ni lilo algorithm išipopada planar. Agbegbe ikosile LacZ laarin awọn aworan akojọpọ tracheal lati ẹranko kọọkan ni a ṣe iwọn nipa lilo iwe afọwọkọ MATLAB adaṣe (R2020a, MathWorks) gẹgẹbi a ti ṣalaye tẹlẹ28, ni lilo awọn eto ti 0.35 <Hue <0.58, Saturation> 0.15, ati Iye <0.7. Agbegbe ti ikosile LacZ laarin awọn aworan akojọpọ tracheal lati ẹranko kọọkan ni a ṣe iwọn nipa lilo iwe afọwọkọ MATLAB adaṣe (R2020a, MathWorks) gẹgẹbi a ti ṣalaye tẹlẹ28, ni lilo awọn eto ti 0.35 <Hue <0.58, Saturation> 0.15, ati Iye <0.7. Площадь экспрессии LacZ в составных изображениях трахеи от каждого животного была количественно определена с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее28, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0 ,7. Agbegbe ti ikosile LacZ ni awọn aworan tracheal apapo lati ẹranko kọọkan ni iwọn nipa lilo iwe afọwọkọ MATLAB adaṣe kan (R2020a, MathWorks) bi a ti ṣalaye tẹlẹ28 ni lilo awọn eto ti 0.350.15 ati iye <0 .7.如前所述，使用自动MATLAB 脚本（R2020a，MathWorks）对来自每只动物的气管复合图像中的LacZ 表达区域进行量化，使用0.35 < 色调< 0.58、饱和度> 0.15 和值< 0.7 的设置。如 前所, 自动 自动 mtab 脚本 脚本 ((R202e, awọn iṣiro) …………………………………………………………. HIP Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного количественно определяли с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0,7 . Awọn agbegbe ti ikosile LacZ lori awọn aworan akojọpọ ti trachea ti ẹranko kọọkan ni a ṣe iwọn nipa lilo iwe afọwọkọ MATLAB adaṣe (R2020a, MathWorks) gẹgẹbi a ti ṣalaye tẹlẹ nipa lilo awọn eto ti 0.35 <hue <0.58, saturation> 0.15 ati iye <0.7.Nipa titọpa awọn ibi isọdi ti ara ni GIMP v2.10.24, iboju-boju kan ni a ṣẹda pẹlu ọwọ fun aworan akojọpọ kọọkan lati ṣe idanimọ agbegbe ti ara ati ṣe idiwọ eyikeyi wiwa eke ni ita iṣan tracheal.Awọn agbegbe ti o ni abawọn lati gbogbo awọn aworan akojọpọ lati ọdọ ẹranko kọọkan ni a ṣe akojọpọ lati fun ni apapọ agbegbe ti o ni abawọn fun ẹranko naa.Agbegbe ti o ya lẹhinna pin nipasẹ agbegbe lapapọ ti iboju-boju lati gba agbegbe deede.
Ọpa kọọkan jẹ ifibọ sinu paraffin ati apakan nipọn 5µm.Awọn apakan ni a tako pẹlu pupa didoju fun awọn iṣẹju 5 ati awọn aworan ni a gba ni lilo microscope Nikon Eclipse E400, kamẹra DS-Fi3 ati sọfitiwia gbigba eroja NIS (ẹya 5.20.00).
Gbogbo awọn itupalẹ iṣiro ni a ṣe ni GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).Pataki iṣiro ti ṣeto ni p ≤ 0.05.A ṣe idanwo deede ni lilo idanwo Shapiro-Wilk ati awọn iyatọ ninu abawọn LacZ ni a ṣe ayẹwo nipa lilo t-idanwo ti ko ni asopọ.
Awọn ọmọ ile-igbimọ mẹfa ti a ṣe apejuwe ninu Table 1 ni PCXI ṣe ayẹwo, ati hihan ni a ṣe apejuwe ni Table 2. Awọn MP polystyrene meji (MP1 ati MP2; 18 µm ati 0.25 µm, lẹsẹsẹ) ko han nipasẹ PCXI, ṣugbọn awọn ayẹwo ti o ku ni a le ṣe idanimọ. (awọn apẹẹrẹ han ni Figure 5).MP3 ati MP4 jẹ ailagbara han (10-15% Fe3O4; 0.25 µm ati 0.9 µm, lẹsẹsẹ).Botilẹjẹpe MP5 (98% Fe3O4; 0.25 µm) ni diẹ ninu awọn patikulu ti o kere julọ ti idanwo, o jẹ pipe julọ.Ọja CombiMag MP6 nira lati ṣe iyatọ.Ni gbogbo awọn ọran, agbara wa lati ṣe awari awọn MF ti ni ilọsiwaju pupọ nipasẹ gbigbe oofa pada ati siwaju ni afiwe si capillary.Bi awọn oofa ti n lọ kuro ni capillary, a fa awọn patikulu jade ni awọn ẹwọn gigun, ṣugbọn bi awọn oofa ti sunmọ ati agbara aaye oofa ti pọ si, awọn ẹwọn patiku ti kuru bi awọn patikulu ti lọ si ọna oke ti capillary (wo Afikun Fidio S1 : MP4), jijẹ iwuwo patiku ni dada.Lọna miiran, nigba ti o ba yọ oofa kuro ni ori opo, agbara aaye yoo dinku ati pe awọn MP4 yoo tunto sinu awọn ẹwọn gigun ti o njade lati oke oke ti capillary (wo Afikun Fidio S2: MP4).Lẹhin ti oofa naa duro gbigbe, awọn patikulu naa tẹsiwaju lati gbe fun igba diẹ lẹhin ti wọn de ipo iwọntunwọnsi.Bi MP ṣe nlọ si ọna ati kuro lati oke oke ti capillary, awọn patikulu oofa maa n fa idoti nipasẹ omi.
Hihan ti MP labẹ PCXI yatọ ni riro laarin awọn ayẹwo.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 ati (d) MP6.Gbogbo awọn aworan ti o han nihin ni a ya pẹlu oofa kan ti o wa ni isunmọ 10 mm taara loke opo ẹjẹ.Awọn iyika nla ti o han gbangba jẹ awọn nyoju afẹfẹ ti o ni idẹkùn ninu awọn capillaries, ti n ṣafihan ni kedere awọn ẹya eti dudu ati funfun ti aworan itansan alakoso.Awọn pupa apoti tọkasi awọn magnification ti o iyi awọn itansan.Ṣe akiyesi pe awọn iwọn ila opin ti awọn iyika oofa ni gbogbo awọn eeya kii ṣe iwọn ati pe o to awọn akoko 100 tobi ju ti a fihan.
Bi oofa ti n lọ si apa osi ati sọtun pẹlu oke ti capillary, igun ti okun MP yoo yipada lati ni ibamu pẹlu oofa (wo Nọmba 6), nitorinaa ṣe iyatọ awọn laini aaye oofa.Fun MP3-5, lẹhin ti kọọdu ti de igun ẹnu-ọna, awọn patikulu fa pẹlu oke oke ti capillary.Èyí sábà máa ń yọrí sí dídìpọ̀ sí àwọn ẹgbẹ́ ńlá nítòsí ibi tí pápá oofa ti lágbára jù lọ (wo S3 Àfikún Fídíò: MP5).Eyi tun han gbangba paapaa nigbati aworan ba sunmọ opin ti capillary, eyiti o jẹ ki MP pọ ati ki o ṣojumọ ni wiwo olomi-afẹfẹ.Awọn patikulu inu MP6, eyiti o nira lati ṣe iyatọ ju awọn ti o wa ninu MP3-5, ko fa nigbati oofa ba lọ si ori opo, ṣugbọn awọn okun MP ti yapa, ti nlọ awọn patikulu ni wiwo (wo Afikun Fidio S4: MP6).Ni awọn igba miiran, nigbati aaye oofa ti a lo ti dinku nipasẹ gbigbe oofa ni ijinna pipẹ si aaye aworan, eyikeyi awọn ọmọ ile-igbimọ ti o ku laiyara sọkalẹ si ilẹ isalẹ ti tube nipasẹ agbara walẹ, ti o ku ninu okun (wo Afikun Fidio S5: MP3) .
Igun ti okun MP n yipada bi oofa ti n lọ si apa ọtun loke opo ẹjẹ.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 ati (d) MP6.Awọn pupa apoti tọkasi awọn magnification ti o iyi awọn itansan.Jọwọ ṣakiyesi pe awọn afikun awọn fidio wa fun awọn idi alaye bi wọn ṣe ṣafihan igbekalẹ patikulu pataki ati alaye ti o ni agbara ti a ko le fojuwo ni awọn aworan aimi wọnyi.
Awọn idanwo wa ti fihan pe gbigbe oofa sẹhin ati siwaju laiyara lẹgbẹẹ ọna atẹgun n ṣe iworan ti MF ni aaye ti gbigbe eka ni vivo.Ko si awọn idanwo in vivo ti a ṣe nitori pe awọn ilẹkẹ polystyrene (MP1 ati MP2) ko han ninu capillary.Ọkọọkan ninu awọn MF mẹrin ti o ku ni idanwo ni vivo pẹlu ipo gigun ti oofa ti o wa ni ipo lori trachea ni igun kan ti o to 30° si inaro (wo Awọn nọmba 2b ati 3a), nitori eyi yorisi awọn ẹwọn MF gigun ati pe o munadoko diẹ sii. ju oofa..iṣeto ni fopin.MP3, MP4 ati MP6 ko ti ri ninu ọra ti awọn ẹranko laaye.Nigbati o ba n wo oju-ọna atẹgun ti awọn eku lẹhin ti eniyan pa awọn ẹranko, awọn patikulu naa wa alaihan paapaa nigba ti a ṣafikun iwọn didun afikun nipa lilo fifa syringe kan.MP5 ni akoonu ohun elo afẹfẹ irin ti o ga julọ ati pe o jẹ patikulu ti o han nikan, nitorinaa a lo lati ṣe iṣiro ati ṣe afihan ihuwasi MP ni vivo.
Gbigbe oofa sori atẹgun lakoko fifi sii MF yorisi ọpọlọpọ, ṣugbọn kii ṣe gbogbo rẹ, awọn MF ni ogidi ni aaye wiwo.Titẹ sii tracheal ti awọn patikulu ni a ṣe akiyesi dara julọ ni awọn ẹranko euthanized ti eniyan.Nọmba 7 ati Fidio S6 Afikun: MP5 ṣe afihan gbigba oofa iyara ati titete awọn patikulu lori dada ti ventral trachea, ti o nfihan pe awọn MPs le ṣe ifọkansi si awọn agbegbe ti o fẹ ti trachea.Nigbati o ba n wa diẹ sii distally ni ọna atẹgun lẹhin ifijiṣẹ MF, diẹ ninu awọn MF ni a rii isunmọ si carina, eyiti o tọka si agbara aaye oofa ti ko to lati gba ati mu gbogbo awọn MF mu, niwọn igba ti wọn ti jiṣẹ nipasẹ agbegbe ti agbara aaye oofa ti o pọju lakoko iṣakoso ito.ilana.Sibẹsibẹ, awọn ifọkansi MP lẹhin ibimọ ga ni agbegbe aworan, ni iyanju pe ọpọlọpọ awọn MPS wa ni awọn agbegbe oju-ofurufu nibiti agbara aaye oofa ti o lo ga julọ.
Awọn aworan ti (a) ṣaaju ati (b) lẹhin ifijiṣẹ ti MP5 sinu ọna atẹgun ti eku euthanized laipẹ pẹlu oofa ti a gbe ni oke agbegbe aworan naa.Agbegbe ti a fihan wa laarin awọn oruka cartilaginous meji.Omi diẹ wa ninu awọn ọna atẹgun ṣaaju ki MP to wa ni jiṣẹ.Awọn pupa apoti tọkasi awọn magnification ti o iyi awọn itansan.Awọn aworan wọnyi ni a ya lati inu fidio ti o ṣe afihan ni S6: MP5 Fidio Afikun.
Gbigbe oofa lẹba ọna atẹgun ni vivo yorisi iyipada ni igun ti pq MP lori oju ọna atẹgun, ti o jọra ti a ṣe akiyesi ni awọn capillaries (wo Nọmba 8 ati Fidio S7: MP5).Bibẹẹkọ, ninu iwadi wa, a ko le fa awọn ọmọ ile-igbimọ lọ si oju awọn atẹgun atẹgun ti ngbe, bi awọn capillaries le ṣe.Ni awọn igba miiran, MP pq n gun bi oofa ti n lọ si osi ati sọtun.O yanilenu, a tun rii pe pq patiku naa yipada ijinle ti Layer dada ti ito nigbati oofa ti gbe ni gigun ni gigun ti atẹgun, ati gbooro nigbati oofa naa ba gbe taara si oke ati pe pq patiku ti yiyi si ipo inaro (wo wo. Fidio afikun S7).: MP5 ni 0:09, isalẹ ọtun).Apẹrẹ iṣipopada abuda ti yipada nigbati oofa ti gbe ni ita kọja oke atẹgun (ie, si apa osi tabi ọtun ti ẹranko, dipo gigun ti trachea).Awọn patikulu naa tun han ni gbangba lakoko gbigbe wọn, ṣugbọn nigbati a ti yọ oofa kuro ninu atẹgun atẹgun, awọn imọran ti awọn okun patiku naa han (wo Fidio S8 Afikun: MP5, bẹrẹ ni 0:08).Eyi gba pẹlu ihuwasi akiyesi ti aaye oofa labẹ iṣe ti aaye oofa ti a lo ninu capillary gilasi kan.
Awọn aworan apẹẹrẹ ti o nfihan MP5 ninu ọra ti eku anesthetized laaye.(a) Oofa naa ni a lo lati gba awọn aworan loke ati si apa osi ti trachea, lẹhinna (b) lẹhin gbigbe oofa si apa ọtun.Awọn pupa apoti tọkasi awọn magnification ti o iyi awọn itansan.Awọn aworan wọnyi wa lati fidio ti o ṣe afihan ni S7's Afikun Fidio: MP5.
Nigbati awọn ọpá meji ti wa ni aifwy ni iṣalaye ariwa-guusu loke ati ni isalẹ ọna atẹgun (ie, fifamọra; eeya. 3b), awọn kọọdu MP han gun ati pe o wa lori ogiri ita ti trachea ju ki o wa ni oju ẹhin ti ita. trachea (wo Àfikún).Fidio S9: MP5).Sibẹsibẹ, awọn ifọkansi giga ti awọn patikulu ni aaye kan (ie, oju ẹhin ti trachea) ni a ko rii lẹhin iṣakoso ito nipa lilo ẹrọ oofa meji, eyiti o maa nwaye pẹlu ẹrọ oofa kan.Lẹhinna, nigbati a tunto oofa kan lati kọ awọn ọpá idakeji (Figure 3c), nọmba awọn patikulu ti o han ni aaye wiwo ko pọ si lẹhin ifijiṣẹ.Ṣiṣeto awọn atunto oofa mejeeji jẹ nija nitori agbara aaye oofa giga eyiti o ṣe ifamọra tabi titari awọn oofa ni atele.Eto naa lẹhinna yipada si oofa kan ti o ni afiwe si awọn ọna atẹgun ṣugbọn ti nkọja nipasẹ awọn ọna atẹgun ni igun iwọn 90 ki awọn ila ti agbara rekọja odi tracheal orthogonally (Figure 3d), iṣalaye ti a pinnu lati pinnu iṣeeṣe ti akopọ patiku lori odi ita.ṣe akiyesi.Bibẹẹkọ, ninu atunto yii, ko si agbeka ikojọpọ MF ti o ṣe idanimọ tabi gbigbe oofa.Ni ibamu si gbogbo awọn abajade wọnyi, iṣeto kan pẹlu oofa kan ati iṣalaye iwọn 30 ni a yan fun awọn iwadii vivo ti awọn gbigbe jiini (Fig. 3a).
Nigbati a ti ya aworan ẹranko naa ni ọpọlọpọ igba lẹsẹkẹsẹ lẹhin ti o ti rubọ pẹlu eniyan, isansa ti iṣipopada iṣan ara tumọ si pe awọn laini patiku ti o dara julọ, kukuru ni a le rii ni aaye intercartilaginous ti o han gbangba, 'swaying' ni ibamu pẹlu išipopada translational ti oofa.kedere ri niwaju ati ronu ti MP6 patikulu.
Titer LV-LacZ jẹ 1.8 x 108 IU/mL, ati lẹhin ti o dapọ 1:1 pẹlu CombiMag MP (MP6), awọn ẹranko ni itasi pẹlu 50 µl ti iwọn lilo tracheal ti 9 x 107 IU/ml ti ọkọ LV (ie 4.5). x 106 TU/eku).)).Ninu awọn ẹkọ wọnyi, dipo gbigbe oofa lakoko iṣẹ, a ṣeto oofa si ipo kan lati pinnu boya gbigbe LV le (a) dara si ni akawe si ifijiṣẹ fekito ni laisi aaye oofa, ati (b) ti ọna atẹgun ba le wa ni idojukọ.Awọn sẹẹli ti n yipada ni awọn agbegbe ibi-afẹde oofa ti apa atẹgun oke.
Iwaju awọn oofa ati lilo CombiMag ni apapo pẹlu awọn olutọpa LV ko han lati ni ipa lori ilera ẹranko, gẹgẹ bi ilana ifijiṣẹ LV boṣewa wa.Awọn aworan iwaju ti agbegbe tracheal ti o tẹriba rudurudu ẹrọ (Eya afikun. 1) fihan pe ẹgbẹ ti a tọju LV-MP ni awọn ipele ti o ga julọ ti gbigbe ni iwaju oofa (Fig. 9a).Nikan kan kekere iye ti bulu LacZ idoti wà bayi ni awọn iṣakoso ẹgbẹ (Figure 9b).Isọdiwọn ti awọn agbegbe ti o ṣe deede ti X-Gal fihan pe iṣakoso LV-MP ni iwaju aaye oofa kan yorisi ilọsiwaju isunmọ 6-agbo (Fig. 9c).
Apeere ti awọn aworan akojọpọ ti o nfihan itusilẹ tracheal pẹlu LV-MP (a) ni iwaju aaye oofa ati (b) ni aini oofa.(c) Ilọsiwaju iṣiro ti iṣiro ni agbegbe deede ti gbigbe LacZ ni ọna atẹgun pẹlu lilo oofa kan (* p = 0.029, t-test, n = 3 fun ẹgbẹ kan, tumọ si ± aṣiṣe boṣewa ti apapọ).
Awọn apakan abariwon pupa ti o yara (apẹẹrẹ ti o han ni Aworan Apọju. 2) tọka si pe awọn sẹẹli ti o ni abawọn LacZ wa ni apẹẹrẹ kanna ati ni ipo kanna gẹgẹbi a ti royin tẹlẹ.
Ipenija bọtini ni itọju ailera jiini ọna atẹgun si wa ni isọdi deede ti awọn patikulu ti ngbe ni awọn agbegbe iwulo ati aṣeyọri ti ipele giga ti ṣiṣe gbigbe ni ẹdọforo alagbeka ni iwaju ṣiṣan afẹfẹ ati imukuro mucus ti nṣiṣe lọwọ.Fun awọn gbigbe LV ti a pinnu fun itọju awọn aarun atẹgun ni cystic fibrosis, jijẹ akoko ibugbe ti awọn patikulu ti ngbe ni awọn ọna atẹgun conductive ti jẹ ibi-afẹde ti ko ṣee ṣe.Gẹgẹbi a ti tọka nipasẹ Castellani et al., Lilo awọn aaye oofa lati jẹki gbigbejade ni awọn anfani lori awọn ọna ifijiṣẹ jiini miiran bii elekitiroporation nitori pe o le ṣajọpọ ayedero, eto-ọrọ aje, ifijiṣẹ agbegbe, ṣiṣe pọ si, ati akoko isubu kukuru.ati o ṣee ṣe iwọn kekere ti ọkọ10.Bibẹẹkọ, ni ifisilẹ vivo ati ihuwasi ti awọn patikulu oofa ni awọn ọna atẹgun labẹ ipa ti awọn agbara oofa ita gbangba ko ti ṣe apejuwe rara, ati ni otitọ agbara ti ọna yii lati mu awọn ipele ikosile jiini pọ si ni awọn ọna atẹgun laaye ko ti ṣe afihan ni vivo.
Awọn adanwo in vitro wa lori PCXI synchrotron fihan pe gbogbo awọn patikulu ti a ṣe idanwo, ayafi ti MP polystyrene, ni o han ni iṣeto aworan ti a lo.Ni iwaju aaye oofa, awọn aaye oofa dagba awọn okun, gigun eyiti o ni ibatan si iru awọn patikulu ati agbara aaye oofa (ie, isunmọ ati gbigbe ti oofa).Gẹgẹbi a ṣe han ni Nọmba 10, awọn okun ti a ṣe akiyesi ni a ṣẹda bi patiku kọọkan ti di magnetized ti o si fa aaye oofa agbegbe tirẹ.Awọn aaye ọtọtọ wọnyi fa awọn patikulu iru miiran lati gba ati sopọ pẹlu awọn iṣipopada okun ẹgbẹ nitori awọn ipa agbegbe lati awọn ipa agbegbe ti ifamọra ati ifasilẹ awọn patikulu miiran.
Aworan ti o nfihan (a, b) awọn ẹwọn ti awọn patikulu ti o n ṣe inu awọn capillaries ti omi-omi ati (c, d) trachea ti o kun afẹfẹ.Ṣe akiyesi pe awọn capillaries ati trachea ko fa si iwọn.Igbimọ (a) tun ni apejuwe ti MF ti o ni awọn patikulu Fe3O4 ti a ṣeto sinu awọn ẹwọn.
Nigbati oofa ba gbe lori kapilari, igun ti okun patiku de ibi ti o ṣe pataki fun MP3-5 ti o ni Fe3O4 ninu, lẹhin eyi okun patiku ko tun wa ni ipo atilẹba rẹ, ṣugbọn o gbe ni oju ilẹ si ipo titun kan.oofa.O ṣee ṣe pe ipa yii waye nitori oju ti capillary gilasi jẹ dan to lati jẹ ki iṣipopada yii waye.O yanilenu, MP6 (CombiMag) ko huwa ni ọna yii, boya nitori pe awọn patikulu kere, ni ibora ti o yatọ tabi idiyele dada, tabi omi ti ngbe ohun-ini ni ipa lori agbara wọn lati gbe.Iyatọ ninu aworan patiku CombiMag tun jẹ alailagbara, ni iyanju pe omi ati awọn patikulu le ni iwuwo kanna ati nitorinaa ko le ni irọrun gbe si ara wọn.Awọn patikulu tun le di ti oofa naa ba yara ju, ti o nfihan pe agbara aaye oofa ko le bori ija nigbagbogbo laarin awọn patikulu inu omi, ni iyanju pe agbara aaye oofa ati aaye laarin oofa ati agbegbe ibi-afẹde ko yẹ ki o wa bi a iyalenu.pataki.Awọn abajade wọnyi tun tọka pe botilẹjẹpe awọn oofa le gba ọpọlọpọ awọn microparticles ti n ṣan nipasẹ agbegbe ibi-afẹde, ko ṣeeṣe pe awọn oofa le gbarale lati gbe awọn patikulu CombiMag lẹgbẹẹ oju-ọna ti trachea.Nitorinaa, a pari pe ni vivo LV awọn iwadii MF yẹ ki o lo awọn aaye oofa aimi lati dojukọ awọn agbegbe kan pato ti igi atẹgun.
Ni kete ti a ti fi awọn patikulu sinu ara, wọn nira lati ṣe idanimọ ni aaye ti iṣan gbigbe ti ara ti ara, ṣugbọn agbara wiwa wọn ti ni ilọsiwaju nipasẹ gbigbe oofa ni ita lori atẹgun lati “wiggle” awọn okun MP.Lakoko ti awọn aworan akoko gidi ṣee ṣe, o rọrun lati ṣe akiyesi iṣipopada patiku lẹhin ti a ti pa ẹranko naa pẹlu itara eniyan.Awọn ifọkansi MP nigbagbogbo ga julọ ni ipo yii nigbati oofa ti wa ni ipo lori agbegbe aworan, botilẹjẹpe diẹ ninu awọn patikulu ni a maa n rii siwaju si isalẹ oju-ọpa.Ko dabi awọn ẹkọ in vitro, awọn patikulu ko le fa si isalẹ ọna atẹgun nipasẹ gbigbe oofa kan.Wiwa yii wa ni ibamu pẹlu bii mucus ti o bo oju ti atẹgun n ṣe ilana awọn patikulu ifasimu ni igbagbogbo, di wọn sinu mucus ati lẹhinna nu wọn kuro nipasẹ ẹrọ imukuro muco-ciliary.
A pinnu pe lilo awọn oofa loke ati ni isalẹ ọna atẹgun fun ifamọra (Ọpọtọ 3b) le ja si ni aaye oofa aṣọ kan diẹ sii, dipo aaye oofa ti o ni idojukọ gaan ni aaye kan, ti o le ja si pinpin isokan diẹ sii ti awọn patikulu..Sibẹsibẹ, iwadii alakoko wa ko rii ẹri ti o daju lati ṣe atilẹyin idawọle yii.Bakanna, siseto bata ti awọn oofa lati fagilee (Fig. 3c) ko ja si idasile patiku diẹ sii ni agbegbe aworan.Awọn awari meji wọnyi ṣe afihan pe iṣeto oofa-meji ko ni ilọsiwaju iṣakoso agbegbe ti itọka MP, ati pe awọn agbara oofa ti o lagbara ti o ṣoro lati tune, ṣiṣe ọna yii ko wulo.Bakanna, iṣalaye oofa loke ati kọja trachea (Figure 3d) tun ko pọ si nọmba awọn patikulu ti o ku ni agbegbe aworan.Diẹ ninu awọn atunto omiiran wọnyi le ma ṣe aṣeyọri bi wọn ṣe yọrisi idinku ninu agbara aaye oofa ni agbegbe ifisilẹ.Nitorinaa, iṣeto oofa ẹyọkan ni awọn iwọn 30 (Fig. 3a) ni a gba pe o rọrun julọ ati daradara julọ ni ọna idanwo vivo.
Iwadi LV-MP fihan pe nigba ti a ṣe idapo awọn olutọpa LV pẹlu CombiMag ati jiṣẹ lẹhin idamu nipa ti ara ni iwaju aaye oofa, awọn ipele iyipada pọ si ni pataki ninu trachea ni akawe si awọn iṣakoso.Da lori awọn iwadii aworan synchrotron ati awọn abajade LacZ, aaye oofa naa han lati ni anfani lati tọju LV ninu trachea ati dinku nọmba awọn patikulu vector ti o wọ inu jinlẹ si ẹdọforo lẹsẹkẹsẹ.Iru awọn ilọsiwaju ìfọkànsí le ja si ṣiṣe ti o ga julọ lakoko ti o dinku awọn titers ti a firanṣẹ, iyipada ti ko ni idojukọ, iredodo ati awọn ipa ẹgbẹ ajẹsara, ati awọn idiyele gbigbe jiini.Ni pataki, ni ibamu si olupese, CombiMag le ṣee lo ni apapo pẹlu awọn ọna gbigbe jiini miiran, pẹlu awọn aarun ọlọjẹ miiran (bii AAV) ati awọn acids nucleic.